农业部关于印发《2017年动物源细菌耐药性监测计划》的通知

文件名称:农业部关于印发《2017年动物源细菌耐药性监测计划》的通知

文件编号:农医发[2017]4号

发布时间:2017-02-14

实施时间:2017-02-14

三、动物源金黄色葡萄球菌的分离与鉴定

1  范围

本标准规定了用于耐药性测定的动物源金黄色葡萄球菌的分离和鉴定方法。

本标准适用于牛奶、动物组织和上呼吸道中金黄色葡萄球菌的分离和鉴定。

2  设备和材料

   除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1  冰箱：0℃-4℃和-20℃。

2.2  恒温培养箱：36℃±1℃和42℃。

2.3  显微镜：10×～100×。

2.4  商品化或自制采样管。

2.5  无菌离心管

2.6  离心机。

2.8  商品化拭条或微生物鉴定仪。

3  培养基和试剂

3.1  标准菌株：金黄色葡萄球菌ATCC29213

3.2  显色培养基

3.3  7.5 %氯化钠肉汤10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤

3.4  营养肉汤或BHI肉汤 

3.5  营养琼脂 

3.6  新鲜兔血浆或商品用凝固酶试验兔血浆 

3.7  0.3%过氧化氢液 

3.8  0.85%无菌生理盐水 

4  金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序

金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序见图3。

 图3  金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序

5  操作步骤

5.1  采样

5.1.1牛奶样品：到已选定的奶牛养殖场，现场采牛奶置入灭菌试管中，0-4℃保存，不超过48h。

5.1.2扁桃体、发病动物组织和上呼吸道拭子：无菌操作取发病动物组织和上呼吸道拭子，上呼吸道拭子置入灭菌试管中，0-4℃保存不超过48h。

5.1.3  吸取1mL牛奶样品或将上呼吸道拭子至盛有10mL 7.5%氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤中，振荡混匀。

5.2    增菌和分离培养

5.2.1  将上述样品匀液于36±1 ℃培养18-24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。

5.2.2  将上述培养物，分别划线接种到显色培养基平板上，无菌操作将发病动物组织直接划线， 36±1 ℃培养24-48h。

5.2.3  挑取可疑菌落。用营养琼脂纯化一代，待进一步细菌鉴定。

5.3  金黄色葡萄球菌的鉴定

5.3.1生化鉴定  将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验，应为阳性。

将新鲜纯化、经触酶试验阳性待检细菌单个菌落，悬浮于5mL灭菌生理盐水，按照生化鉴定试条使用说明书操作， 37℃培养18-24h后判读结果。

5.3.2血浆凝固酶试验法   挑取显色平板上可疑菌落1 个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂平板，36±1℃培养18-24h。将在营养琼脂上培养24h以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验，应为阳性。

    新鲜兔血浆制备：称取柠檬酸钠3.8g，加蒸馏水100mL,溶解后过滤，装瓶，121℃高压灭菌15min。取3.8%柠檬酸钠溶液一份，加兔全血四份，混好静置 (或以3000r/min 离心30 min)，使血液细胞下降，即可得血浆。

  　取新鲜配置兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2-0.3 mL，振荡摇匀，置36±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。