农业部关于印发《2017年动物源细菌耐药性监测计划》的通知

文件名称:农业部关于印发《2017年动物源细菌耐药性监测计划》的通知

文件编号:农医发[2017]4号

发布时间:2017-02-14

实施时间:2017-02-14

        

    四、动物源弯曲杆菌的分离与鉴定

1  范围

本标准规定了动物源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离鉴定方法 。

本标准适用于粪便拭子和盲肠内容物中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离与鉴定。

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备和材料如下。

2.1  采样管

2.2  采样棉拭子

2.3  生物安全柜

2.4  恒温培养箱: 25℃±1℃，36℃±1℃，42℃±1℃。

2.5  恒温水浴锅：37℃～100℃。

2.6  微需氧条件：5%氧气+10%二氧化碳+85%氮气，或商品化微需氧包。

2.7  显微镜：10×～100×。

2.8  微生物生化鉴定系统或者生化鉴定拭条

2.9  高速冷冻离心机：≥12000r/min。

2.10  小型离心管：1.5mL。

2.11  微量加样器：1μL～1000μL。

2.12  吸头（与微量加样器相匹配）

2.13  PCR仪

2.14  微波炉

2.15  电泳仪

2.16  电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪）

3、培养基和试剂

3.1  质控菌株：空肠弯曲杆菌标准菌株（ATCC 33560）

3.2  DNA  Marker 

3.3   引物及扩增片段长度

3.3.1  引物

空肠弯曲菌：上游 5’ CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT  3’，下游 5’AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC  3’，扩增片段长度为 773bp。

结肠弯曲杆菌：上游：AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC，下游：TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGCTAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC，扩增片段长度为364bp。

3.4  运送培养基

3.5  弯曲菌选择性（CCD）培养基

3.6  哥伦比亚血琼脂培养基

3.7  生理盐水

3.8  10 ×PCR 缓冲溶液Ⅱ

3.9  氯化镁溶液（25mM）

3.10  Taq 聚合酶（0.5U/μL）

3.11  dNTPs（2mM） 

3.12  琼脂糖

3.13  50×TAE缓冲液：将242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5M  EDTA（pH8.0），加纯水至1000mL。

1×TAE缓冲液： 临用时将50×TAE缓冲液1份加蒸馏水49份，混匀即可。

3.14  上样缓冲液

3.15  溴化乙锭溶液（10mg/mL）：称取1g溴化乙锭溶于100mL水中，用磁力搅拌器搅拌数小时直至完全溶解，避光冷藏（4℃）保存。

3.16  矿物油

4  空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的分离与鉴定程序

空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的分离与鉴定程序见图4。