农业部关于印发《2017年动物源细菌耐药性监测计划》的通知

文件名称:农业部关于印发《2017年动物源细菌耐药性监测计划》的通知

文件编号:农医发[2017]4号

发布时间:2017-02-14

实施时间:2017-02-14

图4  弯曲杆菌的分离和鉴定程序

5  操作步骤

5.1  分离与纯化

5.1.1 分离

将新鲜或者运送培养基中的粪便拭子或盲肠内容物在CCD培养基上涂抹，用经火焰灭菌并冷却的接种环与涂抹处垂直划线。

5.1.2 培养

将上述接种后的平板置于42℃±1℃恒温培养箱中，在微需氧条件下培养24h-48h。

5.1.3 纯化

观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态。挑取灰色、湿润、凸起、光滑圆润、边缘整齐的可疑单菌落，按3.2的培养条件培养纯化。

5.2鉴定

5.2.1生化鉴定

对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定，并进行结果判定。或者通过5.1-5.4的试验进行分子生物学（PCR）鉴定。

5.2.2  分子生物学（PCR）鉴定

用接种环从哥伦比亚血琼脂培养基上挑取适量的纯培养物置于盛有0.5mL生理盐水的小型离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。再加0.5mL灭菌水，悬浮并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，取出置于冰浴中冷却5min后，12000r/min(4℃)离心2min，取上清作为PCR模板。

5.2.2.1  PCR反应体系

根据不同厂家PCR试剂用量，配制PCR反应体系。同时设立阴性和阳性对照。

5.2.2.2  PCR反应条件

采用的PCR反应条件见下表。

PCR反应程序表

5min, 94℃

1min,94℃，1min,64℃，1min,72℃，2*

1min,94℃，1min,62℃，1min,72℃，2*

1min,94℃，1min,60℃，1min,72℃，2*

1min,94℃，1min,58℃，1min,72℃，2*

1min,94℃，1min,56℃，1min,72℃，2*

1min,94℃，1min,54℃，1min,72℃，30*