农业部关于印发《2017年动物源细菌耐药性监测计划》的通知

文件名称:农业部关于印发《2017年动物源细菌耐药性监测计划》的通知

文件编号:农医发[2017]4号

发布时间:2017-02-14

实施时间:2017-02-14

图2 沙门氏菌的分离和鉴定程序

5.操作步骤

5.1 采样  

选择养殖场或屠宰场，用灭菌棉拭子采集动物肠道或泄殖腔（肛门）样品，置入运送培养基中，保存时间不超过48小时。

5.2 沙门氏菌的分离

5.2.1 将拭子置于SC增菌液，36±1℃培养18-24h 或TTB增菌液，42±1℃培养22-24h。

5.2.2 将菌液混匀，接种沙门氏菌显色培养基，36±1℃培养22-24h。

5.2.3 挑取沙门氏菌显色培养基上紫色可疑菌落，接种营养琼脂平板，36±1℃培养16-24h，待进一步细菌鉴定。

5.3 沙门氏菌的鉴定

5.3.1 生化鉴定 

对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定，或者通过5.3.2的方法进行分子生物学（PCR）鉴定。

必要时，用沙门氏菌标准血清进行血清型鉴定。

5.3.2 PCR法鉴定

5.3.2.1 PCR模板的制备

用接种环从营养琼脂上挑选16-24h的纯培养物，置于0.5mL灭菌生理盐水中，12000r/min离心2min，弃上清。再加0.5mL灭菌水，悬浮并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷却后以12000r/min离心2min，取上清液为PCR模板。

5.3.2.2 PCR反应体系的配制

   根据不同厂家PCR试剂用量，配制PCR反应体系，扩增片段长度约284 bp。

5.3.2.3 PCR反应条件

95℃预变性5min，94ºC变性30s, 64ºC退火30s，72ºC延伸30s, 30个循环，最后72ºC延伸10min，同时设立阴性和阳性对照。 

5.3.2.4 电泳

5.3.2.4.1 1.2%琼脂糖凝胶板的制备

称取1.2g琼脂糖，加入100mL0.5×TBE（或1×TAE）缓冲液中，加入核酸染料，依据样品数选用适宜的梳子，琼脂糖溶化后混匀倒入在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。待凝胶冷却凝固后拔出梳子，取出胶块放入电泳槽中，加0.5×TBE（或1×TAE）缓冲液淹没胶面。

5.3.2.4.2 加样

取10µLPCR扩增产物和3µL上样缓冲液混匀后加入加样孔，每次电泳时，各做一个阳性对照和阴性对照。

5.3.2.4.3 电泳条件

电压110V，电泳时间30min。

5.3.2.5 结果判定

电泳结束后，取出胶块置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。

如果某一待检样品扩增产物的条带与沙门氏菌阳性对照的条带在一条直线上，即条带与加样孔的距离相同，而阴性对照无此条带，则该样品分离到的菌株可初步判定为沙门氏菌，必要时可通过测序来进一步确证。